線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件, 它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。  

JC-1（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential） Ψm 的理想熒光探針?？梢詸z測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時(shí)以單體的形式存在，高濃度時(shí)以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)（matrix）中，形成聚合物（J-aggregates），可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體（monomer），可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1） （Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1）是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

JC-1單體的zui大激發(fā)波長(zhǎng)為514nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)為529nm；JC-1聚合物（J-aggregates）的zui大激發(fā)波長(zhǎng)為585nm，zui大發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。實(shí)際觀察時(shí)，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。

二、試劑盒組份

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、高速離心機(jī)、移液器、1.5m L離心管、載玻片、蓋玻片、PBS、滅菌雙蒸水

四、保存條件：

-20℃保存。JC-1需避光保存，并盡量避免反復(fù)凍融。J染色結(jié)合液也可4℃保存

五、注意事項(xiàng)：

1、JC-1在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2、對(duì)PH變化過(guò)于敏感的細(xì)胞建議用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗滌，或延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間。

3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化受到多種因素的影響，因誘導(dǎo)劑、細(xì)胞株類型，作用時(shí)間的不同而熒光強(qiáng)度比例都有不同，因此沒(méi)有通用標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)償設(shè)門指南，因此每個(gè)試驗(yàn)需設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行熒光補(bǔ)償及設(shè)門。

4、加入JC-1并洗滌后盡量在30分鐘內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。

5、組織需先制備單細(xì)胞懸液或提取純化線粒體后方可進(jìn)行檢測(cè)。

6、如果發(fā)現(xiàn)染色結(jié)合緩沖液中有沉淀，必須全部溶解后才能使用。

7、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

六、操作規(guī)程

1、JC-1染色工作液的配制：

a、取100μL 10×染色結(jié)合液加900μL滅菌雙蒸水稀釋成1× 染色結(jié)合液，混勻并預(yù)熱至37℃；

b、吸取500μL  1×染色結(jié)合液，加入1μL JC-1，劇烈Vortex充分溶解，混勻配成JC-1工作液；

c、因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通過(guò)離心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的顆粒，吸取離心后的上清使用，以消除干擾。離心后的上清為JC-1工作液

2、用適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組【用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑，誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后經(jīng)其它檢測(cè)（如AnnexinV或 Caspase 3活性）證實(shí)確有凋亡產(chǎn)生】，收集細(xì)胞；

3、用PBS洗滌細(xì)胞二次（離心2000rpm，5min），收集不多于1×106的細(xì)胞；

4、取500μL JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；

5、室溫離心（2000rpm，5min）收集細(xì)胞，用500μL 1×染色結(jié)合液洗滌兩次；

6、吸取500μL  1× Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞；

7、   熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀分析。

A、熒光顯微鏡觀察

1．   滴一滴上述細(xì)胞懸液于載玻片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察；

2．   對(duì)于貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō)，也可直接用蓋玻片來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；用PBS洗滌細(xì)胞兩次；

滴加100μL JC-1工作液，加蓋玻片，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15~20min；1×染色結(jié)合液洗滌1~2遍；將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察；

              檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，可以

把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。注意：此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在

zui大激發(fā)波長(zhǎng)和zui大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光

時(shí)的設(shè)置，如觀察GFP或FITC時(shí)的設(shè)置；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙

啶或Cy3時(shí)的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出

現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

B、流式細(xì)胞儀分析

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（Ex=488 nm; Em=530 nm）細(xì)胞凋亡的情況，綠色熒光通過(guò)FITC通道通常為FL1來(lái)檢測(cè)；紅色熒光通過(guò)PI通道通常為FL2來(lái)檢測(cè)。.正常細(xì)胞{FL-1亮,FL-2亮; R1}，凋亡細(xì)胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}，設(shè)門的位置根椐細(xì)胞種類、實(shí)驗(yàn)條件等不同而變化，試驗(yàn)需設(shè)未經(jīng)處理的正常細(xì)胞為陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，根椐陰性和陽(yáng)性對(duì)照組的雙參數(shù)散點(diǎn)圖來(lái)設(shè)定門的位置。

七、應(yīng)用舉例

用凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6h后，參照說(shuō)明書的操作方法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)