大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（二）一步法

【資料簡介】

大腸桿菌轉(zhuǎn)化可以：（1）將重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，增殖和表達(dá)，以獲得目的基因；（2）驗(yàn)證大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞效果；（3）用于分子生物學(xué)其他研究。
實(shí)驗(yàn)材料    大腸桿菌
試劑、試劑盒    TSS葡萄糖LB
儀器、耗材    離心機(jī)分光光度計(jì)搖床
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  按1：100的比例將培養(yǎng)的菌液如人到新鮮的LB培養(yǎng)液中，于37℃培養(yǎng)至為OD600為0.3~0.4。
 
2.  加入等體積的2×TSS于菌液中，在冰上溫和地混勻。
 
3.  將100 μl 感受恣細(xì)菌和1~5 μl DNA加入到一個(gè)冰冷的聚丙烯管或玻璃管中，4℃放置5~60 min。

4.  加入0.9 ml 含20 mmol/l 萄糖的LB培養(yǎng)液，37℃溫和振蕩培養(yǎng)30~60 min 在合適的平扳上挑選轉(zhuǎn)化體。

率電轉(zhuǎn)化法

實(shí)驗(yàn)材料    大腸桿菌
試劑、試劑盒    LBSOC
儀器、耗材    電轉(zhuǎn)化儀離心機(jī)分光光度計(jì)
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  接種一個(gè)單菌落于5 ml LB培養(yǎng)液，37℃溫和振搖培養(yǎng)5 h 或。

2.   將2.5 ml 培養(yǎng)物加人到盛有500 ml LB培養(yǎng)液的2 L 燒瓶中，37℃搖勻振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5~0.6。
 
3.  細(xì)菌在冰水浴冷卻10~15 min，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1升離心瓶中。于2℃，5 000 g 離心20 min 沉淀用5 ml 預(yù)冷的水溶解6。

4.  加入500 ml 冰冷的水，混勻，按步驟3重復(fù)離心1次，立即將上清倒掉，用殘余的液體重懸細(xì)胞。
 
5.  新鮮制得的細(xì)菌

（1）將懸浮液加入到預(yù)冷的50 ml 聚丙烯管中，2℃，5 000 g 離心10 min。

（2）估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積，沉淀用等體積的冰冷水重懸。

（3）按50~300 μl 分裝于預(yù)冷的微量離心管中。

6.  凍存細(xì)菌

（1）加入40 ml 冰冷的10%甘油，混合，然后按照步驟5離心。

（2）估計(jì)沉淀的體積，然后加入等體積的冰冷的10%甘油，重懸菌體。

（3）按50~300 μl 分裝于預(yù)冷的微量離心管中。

（4）于干冰上冷凍并貯存于-80℃。

7.  將電轉(zhuǎn)化儀調(diào)到2.5 kV、 25 μF ，脈沖控制器調(diào)到200~400Ω。

8.  將1 μl 質(zhì)粒DNA加入到盛有新鮮制備的細(xì)菌或融化的凍存細(xì)菌的小管中，混勻。
 
9.  將轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化池中，吸干池的外表面，然后放入樣品槽中。
 
10.  進(jìn)行脈沖電轉(zhuǎn)化，然后取出電轉(zhuǎn)化池，馬上加入1 ml SOC培養(yǎng)液，并且用巴斯德吸管轉(zhuǎn)移到無菌的培養(yǎng)管中。

11.  于37℃，中速振蕩培養(yǎng)30~60 min。

12.  分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。