Native-PAGE常見問題及其解析錦集
1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時預(yù)電泳是怎么回事的?預(yù)電泳時要加6×DNA上樣緩沖液嗎?電泳1-2小時再加結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物嗎?
預(yù)電泳是除去凝膠中沒有聚合的單體和雙體和聚合引發(fā)劑，提高分辨率，不加任何物質(zhì)，一般30-60分鐘后加樣電泳。
2. 銀染的步驟是什么?銀染的關(guān)鍵因素是什么?
步驟是：
(1) 固定：10%冰乙酸30min。
(2) 清洗：雙蒸水沖洗凝膠2次，每次1min。
(3) 染色：染色液(1g*，1.5ml 37%甲醛，1l 雙蒸水?，F(xiàn)配)染色30min。
(4) 清洗：迅速洗凝膠1次。
(5) 顯影：30g碳酸鈉，1.5ml 37%甲醛，200μl 10mg/l *。顯影至清晰帶紋出現(xiàn)。
成功銀染的關(guān)鍵因素包括：
(1) 用超純水(比如，NANOpure或Milli-Q純化)或者是雙蒸水作銀染。
(2) 用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級的碳酸鈉。
(3) 在染色后，水清洗所用時間的長短很重要，用不超過5-10秒的時間清洗膠，然后放入顯色溶液中，一般在水里浸一下就好。
(4) 甲醛和*(400μl/1ml)在使用前，及時加入到顯色液中。
(5) 在使用前及時配染色液。
3. 變性PAGE的上樣緩沖液配方?如何準備上樣的蛋白?是將細胞用超聲破碎,還是用細胞裂解液,大多細胞裂解液中均含有SDS,不知有沒有用于非變性PAGE的裂解液.具有操作步驟是什么?
非變性的page buffer就是0.5xTBE,上樣緩沖液可以用普通的loading buffer，含有Tris,溴芬蘭以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己配。細胞超聲即可，超聲后離心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer為1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。還有一點就是要在配gel時考慮能使蛋白多聚體穩(wěn)定的因素。
4. 做了naive---PAGE沒有條帶，蛋白質(zhì)是純品，分子量很大，怎么回事呢?
因為分子量很大，8%的膠濃度較合適。加樣時加個marker，可以檢測膠制備是否有問題。銀染方法比較靈敏，如果蛋白是一種酶，且可使某種底物顯色的話，可以用活性染色試試，更靈敏。
