1.方法提要

   本標準采用的的方法是計數(shù)濃度法，即通過收集懸浮在空氣中的生物性粒子于專門的培養(yǎng)基（選擇能證實其能夠支持微生物生長的培養(yǎng)基），經(jīng)若干時間和適宜的生長條件讓其繁殖到可見的菌落計數(shù)，以判定該潔凈室的微生物濃度。

2.人員的職責及培訓

   潔凈室（區(qū)）的測試人員應進行本專業(yè)的培訓并獲得相應資格后才能履行對潔凈室（區(qū)）測試的職責，其中包含涉及的衛(wèi)生知識和基本微生物知識。

   潔凈室（區(qū)）的測試人員應選擇與生產(chǎn)操作的空氣潔凈度級別要求相適應的穿戴方式，外面的衣服不能帶進100000級以上的區(qū)域。

3.儀器、輔助設備和培養(yǎng)基

   選擇合適的浮游菌采樣器，包括采用無油的抽氣泵，較低的氣流流速和較大的采樣流量，以保證培養(yǎng)基表面的水分不被吹干。

   本測試需要具備儀器、輔助設備和培養(yǎng)基如下：

   a)浮游菌采樣器；

   b)培養(yǎng)皿；

   c)培養(yǎng)基（大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基）

   d)恒溫培養(yǎng)箱；

   e)高壓蒸汽滅菌器。

4.浮游菌采樣器原理

   浮游菌采樣器一般采用撞擊法原理，可分為狹縫式采樣器、離心式或針孔式采樣器。狹縫式采樣器由內部風機將氣流吸入，通過采樣器的狹縫式平板，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉的平板培養(yǎng)基表面上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。離心式采樣器由于內部風機的高速旋轉，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心力的作用下，空氣中的活微生物的粒子有足夠的時間撞擊到的固形培養(yǎng)基條上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。針孔式采樣器是氣流通過一個金屬蓋吸入，蓋子上是密集的經(jīng)過機械加工的特質小孔，通過風機將收集的細小的空氣流直接撞擊到平板培養(yǎng)基表面上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。

5測試要點

5.1必須按照測試儀器的檢定周期，定期對儀器作檢定。使用校驗合格，且在使用有效期內的儀器。

5.2測試儀器在未進入被測區(qū)域時，若必需，則先清潔表面，或在相應的潔凈室內準備和存放（用保護罩或其他適當?shù)赝庹直Ｗo儀器）。

5.3在100級潔凈室內用紙時，上面應蒙上一張透明不沾塵的覆蓋物，在100級潔凈室內不能用鉛筆盒橡皮。

5.4使用測試儀器時應嚴格按照儀器說明書操作。

5.4.1儀器開機，預熱至穩(wěn)定后，方可按儀器說明書的規(guī)定對儀器進行校正，同時檢查采樣流量，并根據(jù)采樣量設定采樣時間。

5.4.2采樣口必須用便于消毒及化學性能穩(wěn)定的材料制造。

5.4.3采樣管嚴禁滲漏，內壁應光滑。

5.4.4采樣管的長度應根據(jù)測點的高度定，盡量減少彎曲。

6培養(yǎng)皿

6.1一般采用90mm×15mm規(guī)格的培養(yǎng)皿?？筛鶕?jù)所選用采樣器選擇合適的培養(yǎng)皿。

6.2離心式采樣器采用的固形培養(yǎng)條。

7培養(yǎng)基

   大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）或沙氏培養(yǎng)基（SDA）或其他用戶認可并經(jīng)驗證了的培養(yǎng)基。其配制方法見附錄B。

8恒溫培養(yǎng)箱

   必須定期對恒溫培養(yǎng)箱進行校驗。

9測試步驟

9.1測試前儀器、培養(yǎng)皿表面必須嚴格消毒。

9.1.1采樣器進入被測房間前先用消毒房間的消毒劑滅菌，用于100級潔凈室的采樣器宜預先放在被測房間內。

9.1.2用消毒劑擦凈培養(yǎng)皿的外表面。

9.1.3采樣前，先用消毒劑清洗采樣器的頂蓋、轉盤以及罩子的內外面，采樣結束，再用消毒劑輕輕噴射罩子的內壁和轉盤。

9.1.4采樣口及采樣管，使用前必須高溫滅菌。如果消毒劑對采樣管的外壁及內壁進行消毒時，應將管中的殘留液倒掉晾干。

9.1.5采樣者應穿戴與被測潔凈區(qū)域相應的工作服，在轉盤上放入或調換培養(yǎng)皿前，雙手用消毒劑消毒或戴無菌手套操作。

9.1.6采樣儀器經(jīng)消毒后先不放入培養(yǎng)皿，開啟浮游菌采樣器，使儀器中的殘余消毒劑蒸發(fā)，時間不少于5min，并檢查流量并根據(jù)采樣量調整設定采樣時間。

9.1.7關閉浮游菌采樣器，放入培養(yǎng)皿，蓋上蓋子。

9.1.8置采樣口于采樣點后，開啟浮游菌采樣器進行采樣。

10培養(yǎng)

10.1全部采樣結束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

10.2采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在30℃~35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于2d；采用沙氏培養(yǎng)基（SDA）配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在20℃~25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于5d。

10.3每批培養(yǎng)基應有對照試驗，檢驗培養(yǎng)基本身是否污染?？擅颗x定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。

11菌落計數(shù)

11.1用肉眼對培養(yǎng)皿上所有的菌落直接計數(shù)，標記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5~10倍放大鏡檢查，有否遺漏。

11.2若平板上右2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)。

12注意事項

12.1使用前應仔細檢查每個培養(yǎng)皿的質量，培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿有變質、破損或污染的不能使用。

12.2對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)做詳細的記錄。

12.3由于細菌種類繁多，差別甚大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落或培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。