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東北師范大學PLOS發(fā)表CRISPR研究新突破
點擊次數(shù)：697 發(fā)布時間：2015-4-3
來自東北師范大學的研究人員報告稱，他們利用CRISPR/Cas9技術在小鼠中實現(xiàn)了基因組大片段的刪除和插入。這一研究成果發(fā)布在3月24日的《PLOS ONE》雜志上。
東北師范大學的鄭耀武（Yaowu Zheng）教授和馮學超(Xuechao Feng)副教授是這篇論文的共同通訊作者。鄭耀武教授長期從事基因表達和調(diào)節(jié)研究，曾建立了多種轉(zhuǎn)基因動物和基因定位修飾動物模型,在Nature（5篇）, Science （2篇）、PNAS等雜志上發(fā)表多篇重要論文。馮學超副教授的主要研究方向是細胞水通道基因功能及動物轉(zhuǎn)基因技術。
遺傳工程小鼠是一種可用于分析基因功能的強大工具。傳統(tǒng)的方法是通過同源重組來生成攜帶靶突變的小鼠。這種技術利用了培育的胚胎干細胞來獲得嵌合體小鼠。過程繁瑣、成本高昂且費時。近年來，鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應因子核酸酶(TALENs)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)被開發(fā)出來用于基因組編輯。
而CRISPR/Cas9系統(tǒng)是三者之中且zui容易應用的工具。這一系統(tǒng)是通過細菌的II型規(guī)律成簇的間隔短回文重復(CRISPR)序列和它自身一種非常的Cas9核酸酶，來靶向目的基因造成特異的雙鏈斷裂(DSBs)而實現(xiàn)基因組編輯的。其已成功地應用于改造包括斑馬魚、小鼠、猴、大鼠等各種生物和人類細胞（延伸閱讀：北京大學劉東課題組：用CRISPR技術調(diào)控基因表達）。
DNA大片段的插入、刪除或替換是基因組編輯中面臨的一個主要問題，通常片段越大重組的效率就越低。事實上，許多研究報道改造的片段大小都是1kb左右。而在許多情況下，例如刪除基因簇、除去長鏈非編碼RNAs(lncRNA)以及置換調(diào)控序列等都需要改變大片段的基因組序列。盡管一些不同的技術被開發(fā)出來用以解決這問題。例如，利用BAC和YAC系統(tǒng)來靶向相對較大的DNA片段。但其效率卻遠不能令人滿意。
在這篇新文章中，東北師范大學的研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠實現(xiàn)了DNA大片段的刪除和插入，包括刪除大小約為65kb的整個Dip2a基因，以及插入超過5kb的β-半乳糖苷酶(lacZ)報告基因。通過PCR和測序研究人員證實大約11.8% (11/93)的胚胎干細胞克隆65kb刪除結果為陽性。通過G418選擇ES細胞，他們獲得了高靶向效率，左右臂效率分別為46.2% (12/26)和73.1% (19/26)。存活幼崽和注射胚胎定向大片段刪除效率分別為21.4%和6.0%。通過ES細胞轉(zhuǎn)染和直接注射受精卵將lacZ報告基因定向插入NEO cassette的效率分別為27.1% (13/48)和11.1% (2/18)。
作者們表示，這些程序是通過直接共同注射受精卵或用細胞質(zhì)粒DNA共同轉(zhuǎn)染胚胎干細胞，繞過了體外轉(zhuǎn)錄。采用這些方法來生成小鼠模型從技術上講非常容易、節(jié)約時間且符合成本效益，將必定會推動基因功能研究。