大鼠膠質細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)ELISA定量試劑盒操作步驟

本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿及相關液體樣本中膠質細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子

(GDNF)含量。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠膠質細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)水

平。用純化的大鼠膠質細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)抗體包被微孔板，制成固相抗體，

往包被單抗的微孔中依次加入膠質細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，再與HRP標記的膠

質細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹

底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成

zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的膠質細胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)呈正相關。用

酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠膠質細胞系來

源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)濃度。

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能

馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀

釋。

120ng/L5號標準品150µl的原倍標準品加入150µl標準品稀釋液

60ng/L4號標準品150µl的5號標準品加入150µl標準品稀釋液

30ng/L3號標準品150µl的4號標準品加入150µl標準品稀釋液

15ng/L2號標準品150µl的3號標準品加入150µl標準品稀釋液

7.5ng/L1號標準品150µl的2號標準品加入150µl標準品稀釋液

2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、

待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl，

然后再加待測樣品10µl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡

量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此

重復5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標試劑50µl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15分鐘.

10.終止：每孔加終止液50µl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止

液后15分鐘以內進行。

操作程序總結：

計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的

OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，

即為樣品的實際濃度。