用來(lái)檢測(cè)小鼠Ⅲ型前膠原氨基端肽ELISA試劑盒，用的雙抗體夾心法。一般是在小鼠的體外，定量提取小鼠血清、血漿、組織勻漿或者是細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的天然和重組的前膠原氨基端肽。

　　將小鼠的前膠原氨基端肽抗體放到酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的PⅢNP會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入*化的抗小鼠PⅢNP抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素?？剐∈驪ⅢNP抗體與結(jié)合在包被抗體上的小鼠PⅢNP結(jié)合、*與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過(guò)氧化物酶的催化下現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變黃。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，PⅢNP濃度與OD450值之間呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中PⅢNP的濃度。

　　實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μL，注意不要有氣泡，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育90分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

　　2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每個(gè)孔中加入*化抗體工作液100μL（在使用前15分鐘內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時(shí)。

　　3.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。

　　4.每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前15分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。

　　5.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。

　　6.每孔加底物溶液(TMB)100μL，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右（根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長(zhǎng)，但不可超過(guò)30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止）。

　　7.每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶

　　液的加入順序相同。

　　8.立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱

　　儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序。

　　9.實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存。