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肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）試劑盒說(shuō)明書(shū)
For Research Use only
僅供研究用
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）試劑盒說(shuō)明書(shū)貨號(hào)：QYS-239012
分光光度法 50 管/48 樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)
定測(cè)定意義：
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是存在于線粒體內(nèi)膜的一類(lèi)?；D(zhuǎn)移酶?？赡娴卮呋瘡孽；o酶 A
將?；D(zhuǎn)移至 L-肉毒堿的反應(yīng)，在轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸通過(guò)線粒體內(nèi)膜的過(guò)程中起重要作用。
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定原理：
基于肉堿和脂酰輔酶 A 在丙二酰輔酶 A 存在與否的條件下，通過(guò)肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-I)
的作用，產(chǎn)生脂酰肉堿，并釋放出巰基輔酶 A(COA-SH)，與 Ellman 試劑 DN-TB 反應(yīng)
后，產(chǎn)生黃色的 TNB。通過(guò)其吸收峰值得變化（412nm），來(lái)定量分析 CPT-1 的活性。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、無(wú)
水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制：
試劑一：液體 50mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：液體 10mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：液體 1mL×1 支，-20℃保存；
試劑四：液體 55mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）試劑盒說(shuō)明書(shū)樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 稱(chēng)取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻
漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿液于600g，4℃離心5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④ 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的CPT-1（此步可選做）。
⑤ 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20
％或 200W，超聲 3秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30次），用于線粒體 CPT-1 測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）在試劑五中加入 2mL 無(wú)水乙醇，混勻，再加入 44mL 試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）
或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（2）在試劑六中加入 2mL 蒸餾水，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育
5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；
（3）（3）在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、880μL 試劑五和 40μL 試劑六，
混勻，記錄 412nm 處 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 2 分 20秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）試劑盒說(shuō)明書(shū)
CPT-1 活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109
]÷(V 樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109
]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=177.8×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CPT-1 （ nmol/min/104
cell ） =[ΔA×V 反 總 ÷ （ ε×d ） ×109
]÷ （ 500×V 樣 ÷V 樣 總 ）
÷T=0.3556×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.6×10-4
L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×104
L /
mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體
積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；
500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。