細(xì)胞的復(fù)蘇 

細(xì)胞復(fù)蘇的原則——快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。

具體操作 

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

1.將水浴鍋預(yù)熱至37℃。

2.用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

二、取出凍存管：

1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。

2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號。

三、迅速解凍：

1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2.約1～2min后凍存管內(nèi)液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

四、平衡離心：

用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min離心3min。

五、制備細(xì)胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

六、細(xì)胞計(jì)數(shù)：

細(xì)胞濃度以5×10⁵/ml為宜。

七、培養(yǎng)細(xì)胞 

將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5%CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)2～4小時(shí)（或者24～48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

初學(xué)者易犯錯誤：

1.水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。

2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長。

3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

細(xì)胞計(jì)數(shù) 

實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

具體操作：

一、準(zhǔn)備工作：

取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。

二、細(xì)胞懸液制備：

細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25%的*液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等*），吹打制成待測細(xì)胞懸液。

三、細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。

2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍(lán)染液（0.4%）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4.統(tǒng)計(jì)四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)：按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：

（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml=（四個大格子細(xì)胞數(shù)/4）×2×10⁴ 

說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。 

公式中乘以10⁴因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm³，而1ml=1000mm³

四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于10⁴個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。

2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。

4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。

5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

五、初學(xué)者易犯的錯誤：

1. 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

六、本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：

4%臺盼藍(lán)母液：稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時(shí)，用PBS稀釋母液至0.4%即可。

細(xì)胞的凍存 

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

2.接著置于-20℃冰箱，約30～60min。

3.置于-80℃超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項(xiàng)：

1.使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時(shí)戴上手套操作。 

2.不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。

3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。

細(xì)胞的復(fù)蘇 

細(xì)胞復(fù)蘇的原則——快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。

具體操作 

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

1.將水浴鍋預(yù)熱至37℃。

2.用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

二、取出凍存管：

1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。

2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號。

三、迅速解凍：

1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2.約1～2min后凍存管內(nèi)液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

四、平衡離心：

用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min離心3min。

五、制備細(xì)胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

六、細(xì)胞計(jì)數(shù)：

細(xì)胞濃度以5×10⁵/ml為宜。

七、培養(yǎng)細(xì)胞 

將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5%CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)2～4小時(shí)（或者24～48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

初學(xué)者易犯錯誤：

1.水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。

2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延長。

3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。

4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

細(xì)胞計(jì)數(shù) 

實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

具體操作：

一、準(zhǔn)備工作：

取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。

二、細(xì)胞懸液制備：

細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25%的*液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等*），吹打制成待測細(xì)胞懸液。

三、細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。

2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍(lán)染液（0.4%）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

4.統(tǒng)計(jì)四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)：按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：

（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml=（四個大格子細(xì)胞數(shù)/4）×2×10⁴ 

說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。 

公式中乘以10⁴因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm³，而1ml=1000mm³

四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于10⁴個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。

2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。

4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。

5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

五、初學(xué)者易犯的錯誤：

1. 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

六、本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：

4%臺盼藍(lán)母液：稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時(shí)，用PBS稀釋母液至0.4%即可。

細(xì)胞的凍存 

1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

2.接著置于-20℃冰箱，約30～60min。

3.置于-80℃超低溫冰箱中放置過夜。

4.置于液氮罐中長期保存。

5同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項(xiàng)：

1.使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時(shí)戴上手套操作。 

2.不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。

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