線蟲unc-22突變基因
實(shí)驗(yàn)原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA 連接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pMD18-T Vector 末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。將攜帶目的基因的T質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌并對(duì)其進(jìn)行藍(lán)白斑篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒。
1. 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
1） 取出-80℃保存的制備好的感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置10～20min融化；
2） 加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻后冰上放置30～40min；
3） 42℃水浴中熱擊90s，輕輕放回冰上冷卻2min；
4） 加入880µl LB液體培養(yǎng)基（不含氨芐*）和20µl葡萄糖，37℃搖蕩培養(yǎng)1h；
5） 制備X-gal平板：取40μl X-gal、 4µl IPTG和56µl滅菌雙蒸水混勻后均勻地涂布于含100µg/μl氨芐*的LB固體培養(yǎng)基平板上，放置1h以充分吸收；
6） 取適量的菌液（200µl），涂布于X-gal平板上，37℃培養(yǎng)1h后，倒置培養(yǎng)14～16h。
2. 重組質(zhì)粒的篩選
分別挑取白色和藍(lán)色單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基中（含100µg/µl 氨芐*），37℃振蕩過夜培養(yǎng)，用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA。步驟如下：
1） 取適量菌液于1.5 ml的離心管中，瞬時(shí)離心，倒掉培養(yǎng)基，盡可能倒干凈；
2） 加溶液I 100μl，渦旋重新懸浮沉淀；
3） 加溶液II 200μl，輕輕搖勻，在冰上放置3～5min使大腸桿菌裂解，釋放質(zhì)粒DNA；
4） 加預(yù)冷的溶液III 150μl，輕輕顛倒搖勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反應(yīng)；
5） 4℃，12000rpm離心8min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；
6） 以體積比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，輕輕搖勻，靜置2分鐘；
7） 4℃，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；
8） 加入400μl三氯甲烷搖勻， 4℃，12000rpm離心5min；
9） 取上清加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，4℃，12000rpm離心8min；
10） 棄上清液,加75%乙醇1000μl洗滌2次，放置干燥；
11） 加50μl 雙蒸水（含20μg/ml的 RNase），37℃保溫2h，電泳檢測(cè)（電泳中以藍(lán)斑質(zhì)粒DNA為對(duì)照，出現(xiàn)滯后帶的確認(rèn)為重組質(zhì)粒）后-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
3. 重組質(zhì)粒的測(cè)序驗(yàn)證
將提取純化后的質(zhì)粒送至上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序得到克隆基因的堿基序列，分析驗(yàn)證克隆的目的基因的正確性。
