微量快速平板法抗補(bǔ)體試驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)試劑
抗凝保存液中保存的綿羊紅細(xì)胞、馬抗綿羊紅細(xì)胞抗血清（溶血素）、pH值7.4*緩沖液、聚合IgG、0.04%氨溶液。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
12×8孔的U型微量板、稀釋器（50μl）、分液器、離心機(jī)（MSE 6 L，可使U型微量板離心）、72型分光光度計(jì)等。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 致敏綿羊紅細(xì)胞的制備
1） 將5ml抗凝保存液中的紅細(xì)胞2 500 r/min離心5min；
2） 棄去上清液，沉淀細(xì)胞用pH值7.4*緩沖液應(yīng)用液洗滌3次，每次3 500 r/min離心5min；
3） 吸取0.9ml洗滌過(guò)的壓積紅細(xì)胞加入上述緩沖液配成6%紅細(xì)胞懸液；
4） 為了使紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化，取0.2ml稀釋的紅細(xì)胞懸液加入4.8ml 0.04%氨溶液，在72型分光光度計(jì)（波長(zhǎng)541nm，比色杯為1cm），以蒸餾水作空白，讀數(shù)；
5） 根據(jù)以下公式調(diào)整6%紅細(xì)胞懸液的體積（V）：
V體積（ml）=15×光密度0.49
V-15=還需加入6%紅細(xì)胞懸液中的緩沖液毫升數(shù)。
6） 于上述1.5ml 6%紅細(xì)胞懸液中加入1.5ml 1∶150稀釋的溶血素，充分混勻后，37℃水浴15～20min，此種3%致敏綿羊紅細(xì)胞，可于4℃保存過(guò)夜，使用前，再經(jīng)37℃水浴保溫。
2. 豚鼠補(bǔ)體的滴定
1） 于冷凍干燥的豚鼠補(bǔ)體中，加蒸餾水至原來(lái)體積，室溫放置5min，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡；
2） 將上述豚鼠補(bǔ)體用pH值7.4*緩沖液應(yīng)用液作1∶10稀釋?zhuān)p輕混和，避免產(chǎn)生氣泡；
3） 將1∶10豚鼠補(bǔ)體作進(jìn)一步稀釋?zhuān)浞只靹?，避免產(chǎn)生氣泡；
4） 用分液器從每個(gè)補(bǔ)體稀釋度中取50μl移至U型微量板的一行相應(yīng)孔中（每行8孔），第8孔加入50μl、pH值7.4*緩沖液應(yīng)用液作對(duì)照。具體操作時(shí)先加入緩沖液對(duì)照，然后從zui高稀釋度開(kāi)始按順序加入不同稀釋度的補(bǔ)體；
5） 在U型微量板各孔中加入100μl、pH值7.4*緩沖液應(yīng)用液及50μl致敏綿羊紅細(xì)胞；
6） 在微量板上放置一塊玻璃板，周?chē)媚z布密封，以避免液體蒸發(fā)，37℃溫箱內(nèi)放置1h，每20min混勻一次；
7） 于室溫再放置3～4h，使紅細(xì)胞自然沉降，或用MSE 6 L離心機(jī)2000 r/min離心5min；
8） 觀察結(jié)果，對(duì)照孔應(yīng)不溶血，在一般情況下，1∶40補(bǔ)體稀釋孔應(yīng)*溶血。以恰好能使致敏紅細(xì)胞*溶血的zui高補(bǔ)體稀釋度作為補(bǔ)體滴度，稱(chēng)為zui小溶血量（MHD），補(bǔ)體滴度通常為1∶60～1∶80，偶而可達(dá)1∶130。
3. 抗補(bǔ)體活性測(cè)定
1） 在U型微量板上按序號(hào)，每份被檢標(biāo)本一行（12孔），另一行作為對(duì)照，分別加入50μl pH值7.4*緩沖液應(yīng)用液；
2） 第1孔加入50μl被檢標(biāo)本，用稀釋器將標(biāo)本依次作倍比稀釋?zhuān)瑥?∶2～1∶4.096。從zui后1孔中棄去50μl。另將聚合IgG 50μl加于對(duì)照行的*孔中，同法作倍比稀釋?zhuān)?/span>
3） 每孔中加50μl pH值7.4*緩沖液應(yīng)用液；
4） 每孔中再加入2MHD豚鼠補(bǔ)體（如1MHD=1∶80，2MHD=1∶40）；
5） 在微量板上放一塊玻璃板，周?chē)媚z布密封，4℃放置16～18h；
6） 加入50μl致敏綿羊紅細(xì)胞，再用膠布密封；
7） 37℃保溫1h，每20min混勻一次；
8） 室溫再放置2～5h或用MSE 6 L離心機(jī)2000 r/min離心5min；
9） 根據(jù)孔底沉降紅細(xì)胞狀況，按以下五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄結(jié)果：
0級(jí)：*溶血，無(wú)紅細(xì)胞；
1級(jí)：大約溶解75%紅細(xì)胞；
2級(jí)：大約溶解50%紅細(xì)胞；
3級(jí)：大約溶解25%紅細(xì)胞；
4級(jí)：無(wú)溶血。
