大鼠核因子κB亞基p65親和肽（NF-κB p65）ELISA試劑盒使用目的：

     為定量（性）測定活化的目標濃度的血清，血漿，組織勻漿，細胞培養(yǎng)上清及其他生物液體,僅用于科研,不得用于醫(yī)學診斷。

實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被目標物抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的目標物呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

大鼠核因子κB亞基p65親和肽（NF-κB p65）ELISA試劑盒組成

名稱 96孔配置 48孔配置 備注 

微孔酶標板 12孔×8條 12孔×4條 無 

標準品 0.5mL*6管 0.5mL*6管 按說明書復溶 

* 10mL 10mL 無 

檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無 

20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說明書稀釋 

底物A 6mL 3mL 無 

底物B 6mL 3mL 無 

終止液 6mL 3mL 無 

封板膜 2張 2張 無 

說明書 1份 1份 無 

自封袋 1個 1個 無 

大鼠核因子κB亞基p65親和肽（NF-κB p65）ELISA試劑盒樣本處理及要求

1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于2000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8℃ 2000g離心30分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融

3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：2000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑和器材

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

大鼠核因子κB亞基p65親和肽（NF-κB p65）ELISA試劑盒注意事項

1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

9. 不能使用過期產品。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。

1. 標準品復溶：試劑盒提供6管標準品，每管已標定濃度，并且凍干。實驗前在每個標準品管中加入0.5mL*，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動助其溶解，使其恢復為每個標準品管身標注的濃度。

2. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

大鼠核因子κB亞基p65親和肽（NF-κB p65）ELISA試劑盒操作步驟

1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3. 樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板4-5次（也可用洗板機洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算

以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值